Gümnasist biotehnoloogia pealispinnal

Püüan anda ülevaate molekulaarbioloogia mõistetest ja meetoditest, millele tasuks gümnaasiumibioloogias tähelepanu pöörata. Inspiratsiooni sain õpilastele korraldatud külastustest TÜ Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituuti, sealsete õppejõudude loengutest ning õppepäevadest Jeruusalemma Ülikoolis.
 
Loodan et käesolev materjal on õpetajatele abiks, eriti enne gümnaasiumibioloogia II osa õpiku ilmumist. Huviline leiab lisaks põhjalikke kirjutisi TÜ MRI (http://www.tymri.ut.ee/), Eesti Geenikeskuse (http://www.geno mics.ee/), Eesti Biokeskuse (nt http:// www.ebc.ee/GENEETIKA/loengud/) jpm internetilehekülgedelt.
Geen
Õppekava kohaselt peaks gümnasist aru saama, et geen on DNA lõik, mis määrab ära ühe RNA molekuli sünteesi. Põhikoolist kummitab õpilast definitsioon, et geen määrab organismi mingi tunnuse, vahepealse tarkusega öeldi, et geen määrab ühe polüpeptiidahela (valgu) sünteesi. RNA sünteesi määramist tuleks geeni mõiste omandamisel kõige korrektsemaks pidada: nn polüpeptiidahela sünteesi definitsioon jätab tähelepanuta kõik valku mittekodeerivad olulise bioloogilise toimega RNA liigid (tRNA, rRNA, snRNA=small nuclear RNA, st väikesed tuuma RNA-d) peale mRNA, mis tõesti otseselt polüpeptiidahela järjestuse määrab; nn tunnuse definitsioon aga jätab tunnuse mõiste nõnda lahtiseks, et õpilane kaldub siin vaid organismi välistunnustele mõtlema. Kui tunnusena käsitleda aga elementaartunnust, siis võiks selleks olla ka toosama polüpeptiidahel või RNA.
Arusaam geenist kui DNA lõigust vajaks samuti täpsustamist: geen on mittepidev DNA järjestus, s.t ühe geeni võivad moodustada DNA järjestused eri ruumiosades, tähtis on nende “lõikude” ühine talitluslik eesmärk – nad kodeerivad üheskoos üht RNA molekuli. Kõrgema eukarüootse (päristuumse) organismi, sh inimese geenides on eristatavad kaht tüüpi piirkonnad: eksonid ja intronid, vastavalt valku kodeerivad ja mittekodeerivad geeni osad. Lisaks eksonitele ja intronitele on transkriptsiooni (protsess, mille käigus DNA ahela järgi sünteesitakse rakutuumas RNA) käivitamise ja selle kontrollimise seisukohast väga olulised ka geeni regulatoorsed piirkonnad (nt promootor). Samuti rakutuumas toimuva RNA splaisingu käigus lõigatakse RNA molekulist välja introni järjestused. Tekib mRNA, mis toimetatakse tuumast tsütoplasmasse, kus selle järgi toimub translatsioon (valgu süntees). Sarnaselt RNA-ga protsessitakse ka valke pärast translatsiooni – peptiidijärjestusi korraldatakse ümber, modifitseeritakse, ka eemaldatakse. Valgu primaarahel valmib nende protsesside käigus lõplikult, kujunevad valgu kõrgemat järku struktuuritasemed ning valk transporditakse rakus õigesse kohta, kus tema funktsioon avaldub.
Geenidega manipuleerimine
Põgusalt sellest, mida inimesed geenidega teha oskavad.
– Et geeni efektiivsemalt “tööle” panna, vahetatakse geeni algusosas paiknev promootorjärjestus tugevama vastu. Promootorjärjestus on geeni algusosas selleks, et RNA sünteesi teostav ensüüm (valk) suudaks geenile kinnituda ja RNA-d sünteesima hakata. Tuntud aktiivsed geenid on näiteks lihasrakkude kokkutõmbevalke määravad või viiruste geenid. Viies lihasraku üht kokkutõmbevalku, aktiini määrava geeni promootori “uimasema” geeni ette, saamegi tolle geeni määratavat produkti kiiremini ja rohkem. Sarnaselt kasutatakse viiruse geenide promootorjärjestusi. Ka on reguleeriva toimega geeni osade vahetusega võimalik muuta ühest organismist (rakutüübist) pärinevat geeni aktiivseks teist tüüpi organismis (rakutüübis), näiteks eesmärgiga toota mingit inimese valku bakterirakkudes.
– Et viia rakkudesse mingi võõrgeen, tuleb rakud sellele “vastuvõtlikuks” teha, et DNA (meid huvitav geen) sisse pääseks. Üks võimalus on rakumembraani töötlemine sobivate kemikaalidega, DNA rakku “süstimine” peene kapillaari abil, ka “tulistatakse” rakku kulla-partiklitega, millele on kinnitatud teatud DNA jne. Sellisteks manipulatsioonideks kulub sageli küllalt palju DNA-d. Huvipakkuva geeni hõlpsaks paljundamiseks sisestatakse see sageli plasmiidi. Plasmiid on väike rõngasjas DNA molekul, mis replitseerub kromosomaalsest DNA-st sõltumatult. Plasmiide tuntakse mitmesugustes bakterites, seal määravad nad näiteks vastupanuvõime antibiootikumidele. Ühes bakterirakus võib sama plasmiidi olla üle tuhande koopia. Koos plasmiidiga paljundatakse bakterikultuuris ka sinna sisestatud huvipakkuva geeni järjestust.
Inimesi huvitava geeni viimiseks rakkudesse kasutatakse enamasti viirusi (nn viirus-vektorid). Vajalik geen sisestatakse viiruse genoomi ning rakke nakatades sisestab selliselt modifitseeritud viirus ka meid huvitava geeni.
– “Geeni rivist väljalöömine”, nn knock-out meetod: mingi geeni toimimist takistatakse ning vaadatakse, kuidas see mõjub raku või kogu organismi toimimisele. Sarnaselt asendatakse geene nende muudetud variantidega, et näiteks täpsemalt uurida vastavate geenide või valkude omadusi.
Kõik nimetatud toimingud on geneetilised muundamised või geenimanipulatsioonid. Geneetiliselt muundatud organism ehk GMO on organism, kelle pärilikkustegureid on muudetud viisil, mis ei ole looduslikult võimalik.
Päritavate omaduste jälgimiseks on eelistatud need katseorganismid, kes suudavad kiiresti järglasi toota. Põhjus, miks geneetikud katseobjektina äädikakärbestest või pagaripärmist lugu peavad. Geneetiliselt enim uuritud eukarüoodid on peale nimetatute veel üks mullas elav ümaruss (Chaenorhabditis elegans), laborihiir (Mus musculus) ja arengubioloogide lemmikobjekt kannuskonn (Xepopus sp). Nende organismide “populaarsus” tuleneb mitmest asjaolust: suhteliselt väiksest geenide hulgast; lühikesest paljunemistsüklist; varasemast uuritusest, mis mõnikord võib ka juhuslik olla. See ei pea alati tähendama geneetilist uuritust: mingi liigi ehituse, talitluse, biokeemia vms tundmine loob parema eelduse ka geneetilisteks ja molekulaarbioloogilisteks uuringuteks.
Kuidas geeni kätte saada ja näiteks mõne teise DNA molekuliga liita?
On ensüüme, mis DNA-d lõikavad (nukleaasid), taas kokku kleebivad (ligaasid), paljundavad (polümeraasid), modifitseerivad. Näiteks hulk erinevaid restriktaase (spetsiifilisi nukleaase) tunnevad ära DNA kindla järjestuse (mõne, enamasti 4–6 aluspaari ehk base pairs’ pikkuse motiivi) ning lõikavad siis DNA-d sellest kohast. Restriktaasid on looduslikku päritolu, olles bakterites kaitseks võõra DNA vastu. Tänapäeva bioloog vaatab tabelist, millist restriktaasi teatud järjestuse jaoks tarvis – ehk mis tööd mingi ensüüm teha oskab.
DNA järjestuse määramine ehk sekveneerimine
DNA sekveneerimiseks kasutatakse tänapäeval kõige enam DNA ahela sünteesil ehk replikatsioonil põhinevat meetodit. DNA replikatsiooni käigus “ehitatakse” ühe DNA ahela järgi desoksüribonukleotiidest (dT, dC, dA ja dG) uus, matriitsahelaga paarduv (komplementaarne) ahel. Sekveneerimiseks lahutatakse uuritava DNA kaksikspiraal üksikahelaiks, lisatakse sünteesi käivitamiseks vajalikud komponendid, sealhulgas DNA-d paljundav ensüüm (DNA polümeraas) ja desoksüribonukleotiidid. Sekveneerimise seisukohalt on oluline, et lisataks ka didesoksüribonukleotiide (ddT, ddC, ddA, ddG), mille lülitamisel uude DNA ahelasse vastava desoksüribonukleotiidi asemel süntees katkeb. Didesoksüribonukleotiidide hulk võrreldes desoksüribonukleotiidide hulgaga on valitud nii, et sünteesi katkemine ei toimu kohe, vaid on pigem statistiline. Näiteks ddC lisamisel toimub see osa uute sünteesitud ahelate puhul juba esimese C kohal, teiste puhul toimub ühe, mõne või ka paljude dC nukleotiidide lülitumine enne, kui polümeraasile “satub kätte” ddC ja ahela süntees peatub. Nii saadakse samast reaktsioonisegust eri pikkusega DNA lõikude segu, mis kõik lõpevad teatud kindla dd-nukleotiidiga, sest ahela süntees ju neist edasi ei läinud. Elektroforeesil (suunatud liikumisel elektriväljas) liiguvad sellised eri pikkusega DNA järjestused erineva kiirusega. Sünteesitud ahelad on märgitud (tavaliselt on radioaktiivse isotoobiga märgitud üks desoksüribonukleotiididest või on dd-nukleotiidid konjugeeritud fluorestseeruva värviga), mis võimaldab sünteesitud ahelaid elektroforeesi järgselt jälgida. Sellisel viisil vastavad eri pikkusega DNA lõikudele kriipsukesed röntgenfilmil või fluoresentsisignaalide rida. Loomulikult on nn kriipsukese tekkeks vaja palju DNA molekule. Kuna statistiliselt katkeb süntees kõikvõimalikest kohtadest, erinevad kõrvuti paiknevaid kriipsukesi tekitavad DNA-d üksteisest pikkuselt vaid ühe nukleotiidi võrra. Seega, kõrvutades erinevaid didesoksüribonukleotiide sisaldavate reaktsioonisegude elektroforeesi tulemusi, on “loetav” kogu DNA järjestus.
Kasutades vaid üht tüüpi märgistust, tuleb teha neli erinevat reaktsiooni, igasse katseklaasi (koos uuritava DNA ja ensüümidega) lisatakse vaid üht neljast dd-nukleotiidist ning ka elektroforees toimub kõigi nelja reaktsioonisegu puhul eraldi. Tänapäeval valdavalt spetsiaalse automaatse aparatuuri abil tehtava elektroforeesi puhul on erinevad didesoksüribonukleotiidid sageli markeeritud erinevate fluorestseeruvate värvidega, mistõttu piisab vaid ühest reaktsioonisegust.
Lisaks uue ahela sünteesil põhinevale meetodile saab DNA-d sekveneerida ka seda katki lõigates. Analoogiliselt sünteesimeetodiga kasutatakse sel puhul erinevaid kemikaale, mis katkestavad ahela kindla nukleotiidi järel, tekitades eri pikkusega lõike.
DNA test
Organismi DNA on jaotatav kolme gruppi: konserveerunud, vähevarieeruvad ning kõrgelt/ rohkelt varieeruvad järjestused, näiteks STR- ehk Short Tandem Repeats järjestused.
Tandemjärjestused on genoomis teatud arv kordi korduvad DNA järjestused. Tavaliselt kuuluvad nad nn rämps-DNA (junk-DNA) hulka, s.t ei määra ühtegi RNA-d. Näitena võib tuua tandemjärjestuse STR, mille puhul on korduse pikkus 2–5 bp (aluspaari), nende korduste hulk on inimestel erinev (korduvad eri isikute genoomis keskeltläbi 7–20 korda).
STR järjestuse näiteks võiks olla ATGTA TGTATGTATGTATGT ATGTATGT (7*ATGT) või CAGCAGCAGCA G CAGCAGCAGCAGC A GCAGCAG (11*CAG).
STR tandemjärjestuste mitmekesisust populatsioonis nimetatakse STR polümorfismiks. Seega võib ühel isikul olla antud STR-järjestuseks 10*CAG, teisel 7*CAG, kolmandal 14*CAG jne.
Populatsioonigeneetika puhul tuntakse nähtust SNP (Single Nucleotide Polymorfism), s.t isikud erinevad (teatud kohas DNA-s) ühe vaadeldava nukleotiidi poolest. Seega võib isiku tuvastamise puhul kogu DNA uurimise asemel võrrelda lühikesi kordusjärjestusi. Kahe isiku sel meetodil leitav sarnasus on tõenäosuslik, kuigi väga suure tõenäosusega.
Võrreldavate järjestuste hulk sõltub populatsioonist (rahvast) ja seadustest: minimaalseks (rahuldava tõenäosusega õiget vastust andvaks) loetakse vähemalt 6 STR järjestuse võrdlemist/kokkulangevust. USA-s on võrreldavate järjestuste (STR-de) hulk sageli 13, mõnes riigis isegi kuni 33.
Pakun lahendamiseks ülesande. Perekonnas on ema, isa, kolm bioloogilist ning üks adopteeritud laps. Pereliikmete STR-järjestuste võrdlemisel saadi tulemus, mis on toodud allolevas tabelis. Kes isikutest on isa, kes ema, kes adopteeritud ja kes bioloogilised lapsed? (Vastus: a – poeg, b – ema, c – tütar, d – adopteeritud tütar, e – isa, f – poeg).
DNA paljundamine
PCR – polymerase chain reaction – on laialdaselt kasutatav meetod mingi kindla DNA lõigu kiireks juurdetootmiseks (näiteks kriminalistikas vähese koguse DNA proovi uurimiseks, molekulaarses diagnostikas jpm). Meetod põhineb mitmeetapilisel DNA sünteesil, kus eelnevates etappides sünteesitud ahelad on omakorda matriitsiks uute ahelate tootmisele järgnevates etappides (ahelreaktsioon). Täpsemalt hõlmab iga etapp kahte protsessi.
– Kuumutamise toimel lagunevad kaheahelalise DNA ahelad üksteise küljest lahti, s.t keerdunud DNA biheeliksist (kaksikspiraal) saab kaks eraldi üksikahelat.
– Polümeraasi (ensüüm, mis sünteesib DNA-d) toimel sünteesitakse üheahelaliste DNA ahelate järgi neile komplementaarsed (paarduvad) uued DNA ahelad, nii et moodustub taas kaheahelaline DNA. Polümeraasi toimimiseks on vajalikud ka praimerid.*
Kahe nimetatud protsessi mitmekordse (keskmiselt 20–30 korda) kordamise tagajärjel ongi DNA “paljundatud”, s.t teda on nüüd küllaldaselt edaspidisteks uuringuteks (katseteks). Seega, kui alustatame nt ühest molekulist, on meil pärast esimest tsüklit teoreetiliselt 2, pärast teist – 4 molekuli. Edasi toimub paljundamine üha tõusvas tempos (eksponentsiaalselt): 8, 16, 32, 64, 128..., pärast kolmekümnendat tsüklit (umbes kahe-kolme tunni pärast) oleme ühest molekulist saanud juba 2³⁰ = 1073741824 DNA lõiku.
Tänapäeval teostatakse PCR spetsiaalse aparatuuri abil, millel määratakse eesmärgist lähtuv tööreziim. Erinevad polümeraasid pärinevad termofiilsetest (kuumalembelistest) bakteritest.
 
* DNA replikatsiooniks vajatakse praimereid, sest ensüüm (DNA polümeraas) suudab sünteesi alustada vaid praimeri “osutatud” kohast. Praimerid (primer) on DNA järjestused, mis on suutelised seonduma teatud kindla kohaga üheahelalisel DNA-l, millest uue ahela süntees algab. Seega määrab praimerite järjestus ära selle, kas ja millist DNA osa hakatakse paljundama. Praimerid on tavaliselt ca 17– 25 bp pikad. PCR puhul kasutatakse praimerite paari, millest kumbki algatab paljundatava kaheahelalise DNA ühe komplementaarse ahela sünteesi. Kuidas ensüüm teab, millal süntees lõpetada? Alguskoha märgib praimer, ent esimese reaktsioonitsükli pikkus määratakse ajaga (nt 30 sekundit). Sünteesitava ala pikkus määratakse kindlalt ära, kui reaktsioonis toodetud ahelat kasutatakse omakorda matriitsina järgnevates etappides, kuna sellisel juhul on matriitsahela otsaks praimeri seondumiskoht, millest eelmises etapis ahela süntees algas.
Isiku tuvastamise puhul liidetakse praimerid näiteks STR kordustega külgnevate teadaolevate unikaalsete mittekorduvate järjestustega. DNA polümeraas kopeerib PCR-l seega praimeritevahelist ala, sealhulgas meid huvitavat STR järjestust. Nii on PCR-l saadavad DNA-järjestused pikemad kui STR kordused.